Estabelecer uma plataforma biotecnológica para a identificação de possíveis efeitos terapêuticos de compostos canabinóides na Síndrome de Dravet, utilizando preparações neurais humanas criadas em laboratório a partir de células reprogramadas extraídas da urina de crianças acometidas por essa epilepsia infantil de base genética.

A1) Compreender se as diferenças nos possíveis alvos moleculares de fitocanabinoides fundamentam o
"fenótipo epiléptico" dos neurônios e astrócitos dos pacientes com síndrome de Dravet em comparação com
os controles.
A1.1) Gerar e caracterizar neurônios e astrócitos diferenciados das células iPS derivadas de pacientes
de Dravet e controles. Alterações in vitro na proliferação, diferenciação, crescimento de neuritos e
sobrevivência de progenitores neurais e neurônios derivados de células iPS serão examinadas por
imunocitoquímica com marcadores específicos. Realizar a avaliação funcional de funções típicas de "epilepsia"
em cultura neuronal, incluindo a frequência de oscilações elétricas espontâneas e induzidas por estressores
como temperatura elevada e inibidores de GABA-A.
A1.2) Caracterizar a presença de alguns dos alvos moleculares dos fitocanabinoides nos neurônios e
astrócitos por imunocitoquímica (receptores CB1 / CB2, TRPV1, AMPA e GPR55).
A1.3) Investigar a resposta dos neurônios Dravet a alguns anticonvulsivantes utilizados no tratamento
de pacientes com SD: valproato, lamotrigina, topiramato, carbamazepina, oxcarbamazepina, estiripentol e
fitocanabinoides (THC, CBD, THC: misturas de CBD), com o objetivo de mimetizar o perfil farmacológico
observado nos pacientes Dravet que originaram as células iPS.
A.2) Investigar o impacto do tratamento crônico de canabinoides no neurodesenvolvimento humano in vitro,
utilizando neuroesferas e organoides cerebrais.
A.2.1) Gerar neuroesferas derivadas de células iPS e organoides cerebrais para acompanhar o neurodesenvolvimento humano in vitro e caracterizar a distribuição de alvos relevantes do sistema
endocanabinoide (receptores CB1 / CB2, TRPV1, AMPA e GPR55).
A.2.2) Investigar os efeitos do tratamento canabinoide crônico na maturação neuronal in vitro utilizando
os modelos neuroesfera e organoide cerebral de pacientes de Dravet e controles. Vamos acompanhar os
marcadores de neurodesenvolvimento ao longo do tempo.
A.3) Monitorar o amadurecimento da circuitaria elétrica formada por neurônios derivados de iPS Dravet e
controle através de sistema MEA (multi electrode array)
A.3.1) Comparar células Dravet e controles em relação a atividade elétrica espontânea e induzida por
agentes epileptogênicos (p. ex. Picrotoxina ou ausência de magnésio)
A.3.2) Intervir nessa atividade espontânea ou induzida com os agentes do item A.1.3

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