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Descrição do projeto

Ano:
2019.0

Instituição proponente CNPJ:
01.576.817/0001-75

Prazo de execução [em meses]:
36.0

Tema principal:
Acesso, Inovação e Produção de Medicamentos e Tecnologias para a Saúde

Tema secundário:
Métodos de diagnóstico e tratamento em reabilitação/habilitação, Transtorno do espectro autista (TEA)

Valor final [último valor do projeto aprovado e publicado]:
R$ 5.662.444,07

Status:
Em execução

Abrangência territorial:
Municipal

Execução financeira - percentual de execução financeira:
%

Objetivos

Produzir as proteínas humanas DDX3X, UBE2A e ADK e seus mutantes com relevância clínica, utilizando sistema de expressão heterólogo;

Purificar as proteínas DDX3X, UBE2A e ADK utilizando técnicas cromatográficas;

Realizar ensaios enzimáticos com as proteínas purificadas para avaliar a função destas;

Adaptar ensaios bioquímicos da UBE2A e ADK para microplacas de 384 poços;

Adaptar ensaios fenotípicos que permitam medir, por microscopia de fluorescência em microplacas de 384 poços, o acúmulo de DDX3X mutante em grânulos de estresse de neuroblastomas humano (SHSY5Y);

Conduzir campanhas de triagem em moldes high throughput screening (HTS) com as enzimas UBE2A e ADK, assim como de high content screening (HCS) com neuroblastomas que produzam DDX3X mutante, utilizando a biblioteca de produtos naturais disponível no LNBio;

Desreplicar e purificar produtos naturais com ação de modulação das enzimas estudadas;

Executar campanha de HTS com uma coleção de 50.000 moléculas de origem sintética, com propriedades físico-químicas adequadas para permear barreira hemato-encefálica, que será adquirida no decorrer do projeto e utilizada nos ensaios relacionados as enzimas UBE2A, DDX3X e ADK;

Selecionar hits prioritários para caracterização estrutural e funcional com as enzimas e células alvo;

Determinar potência dos hits selecionados frente à atividade das enzimas ADK e UBE2A selvagens e/ou mutantes, bem como sobre o fenótipo causado pela DDX3X mutante;

Estabelecer protocolos para determinação estrutural das enzimas alvo em complexo com os hits selecionados, utilizando metodologias de expertise do CNPEM como cristalografia de proteínas, microscopia eletrônica de partículas únicas e/ou ressonância magnética nuclear;

Realizar os experimentos estruturais estabelecidos para obter modelos tridimensionais de alta resolução dos complexos enzima-ligante;

Executar estudos in vitro com células de neuroblastoma humano para avaliar o impacto dos hits oriundos das campanhas de HTS/HCS sobre a viabilidade, replicação e função neuronal.